События Assassin’s Creed: Brotherhood разворачиваются непосредственно после финала Assassin’s Creed 2. Ученые продолжают сканировать генетическую память Дезмонда Майлза, изучая дальнейшую историю жизни его предка Эцио Аудиторе Флорентийского. В новой игре знакомый поклонникам юноша предстает взрослым мужчиной около сорока пяти лет и является одним из лидеров и наставников ордена ассасинов.